益生腸球菌應用于斷奶仔豬的研究進展
現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖業(yè)極大提高了養(yǎng)殖業(yè)的綜合管理和生產(chǎn)能力。但集約化養(yǎng)殖方式限制了畜禽接觸土壤，不利于動物腸道正常完全菌群的建立，因此，外界環(huán)境條件變化時容易導致幼畜(禽)胃腸道微生物菌群失衡，降低對病原菌抵抗力。例如仔豬早期斷奶腹瀉就是典型的該類引發(fā)疾病，已成為困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的嚴重問題，仔豬從斷奶到肥育前期，斷奶腹瀉造成的損失占全部的 75%。目前主要的解決辦法是改善飼養(yǎng)管理和在日糧中添加飼用抗生素等，但是，長期大量使用的同時，抗生素的弊端也正日益凸現(xiàn)，如造成動物免疫能力的下降，引發(fā)二次感染和繼發(fā)性感染，出現(xiàn)耐藥菌株等，使其應用效果越來越不理想,更為嚴重的是造成畜禽產(chǎn)品中藥物殘留，直接危害人類健康。2005 年聯(lián)合國糧農(nóng)組織 FAO、國際動物衛(wèi)生組織 OIE 和世界衛(wèi)生組織 WHO共同提出了“抗性開端”概念來控制獸用藥品的使用，現(xiàn)已經(jīng)進入了后抗生素時代，未來將徹底禁止在動物飼料中使用抗生素以防止對人類產(chǎn)生的巨大危害，其中歐盟于 2006 年在飼料中全面禁用抗生素類產(chǎn)品。
作為抗生素類物質(zhì)的替代品，能起到生長促進劑作用的飼料添加劑有很多，如益生菌制劑、酸化劑、酶制劑、寡聚糖、植物提取物等。益生菌制劑是通過改善寄主腸道菌群平衡而發(fā)揮有益作用的活的微生物制品。益生腸球菌制劑屬于乳酸菌，是益生菌制劑的一種，屬于腸道共生菌，在很多動物新出生的 2～3d 內(nèi)占優(yōu)勢地位。益生腸球菌由于它生長速度快，有較好的粘附能力，能產(chǎn)生乳酸及一些抗菌物質(zhì)被廣泛用作益生菌制劑。不同來源的腸球菌都可以產(chǎn)生水楊酸(BLIS)和伏爾加霉素(enterocins)，這兩種物質(zhì)具有較好的抑菌效果。但是益生腸球活菌制劑在加工、運輸及保存過程中易失活，在進人人或動物消化道后大多又難以經(jīng)受低 pH值的胃酸、膽汁酸及胰液等的作用，因此，難以有足夠的數(shù)量到達或定居于腸道而發(fā)揮作用，因此其飼用效果報道不一。本文針對益生菌的發(fā)展和腸球菌的益生與應用特點展開論述。
1 益生菌制劑在飼料行業(yè)的發(fā)展
益生菌和益生菌制劑的發(fā)展很快，20 世紀 80 年代初國際市場上只有 26 種醫(yī)用益生素開始使用，而且主要集中在日本。1991 年，德、英、法和丹麥等國就有 50 多種在市場上銷售，范圍涉及豬、肉牛、雞的飼料。我國最早使用的微生態(tài)制劑是乳酶生，現(xiàn)已有大量產(chǎn)品投放市場。半個世紀以來，益生菌制劑顯示了良好的效果，如乳酸桿菌和雙歧桿菌在許多國家首先用于食品及人的保健制品，近年來也被廣泛地用于動物。
1989 年美國食品與藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)和美國飼料管理協(xié)會(Association of American Feed Control Officials，AAFCO)公布了可用于飼料中的公認安全 (genera11y recognized as safe，GRAS)的微生物菌種(表 1 略)，其中包括益生腸球菌，年使用 量在 8000t 以上。我國農(nóng)業(yè)部 1999 年第 105 號文件公布允許使用的微生物種類是 12 種(表 2 略)也包括益生腸球菌。目前用于微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的菌種主要有乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿 菌、鏈球菌、芽孢桿菌及某些酵母和真菌。這些微生物可以單個使用，也可以混合使用。
2 益生腸球菌概述
我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定可用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的微生物有 6 種，即乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、糞鏈球菌(后更名為糞腸球菌)、芽孢桿菌、雙歧桿菌和酵母菌。1906 年 Andrew s 和 Horder 第 一次描述并命名從人類糞便中分離到的革蘭氏陽性球菌為糞鏈球菌，腸球菌被劃分為 Lancefield D 群，歸屬于鏈球菌屬(Streptococcus)。近年來隨著核酸雜交技術(shù)、細胞脂肪酸分析和細胞壁結(jié)構(gòu)分析技術(shù)應用于細菌分類，Schleifer 和 Kilpper 等 1984 年首次提出腸球菌不同于鏈球菌，腸球菌應從鏈球菌屬中脫離開來，形成一個新的腸球菌菌屬(Enterococus)，第九版伯杰細菌鑒定手冊將 Lancefild D 群的糞鏈球菌和屎鏈球菌歸為腸球菌菌屬的種。目前腸球菌分類超過 30 多種。腸球菌在血瓊脂或營養(yǎng)瓊脂表面形成圓形、完整的、光滑的菌落，大多數(shù)菌株不產(chǎn)生溶血反應，少數(shù)產(chǎn)生 α 或 β-溶血反應。腸球菌屬的細菌為革蘭氏陽性球菌，細胞呈球形或卵圓形，(0.6～2.0)μm×(0.6～2～5)μm，單個、多數(shù)菌種成雙或呈短鏈狀排列；在液體培養(yǎng)基中呈成對或短鏈，一般無芽胞，無莢膜，少數(shù)菌種有鞭毛，兼性厭氧。為化能異氧菌，發(fā)酵代謝；可發(fā)酵的碳水化合物的范圍比較廣，主要產(chǎn) L-(十)-乳酸，但不產(chǎn)氣，最終 pH 值為 4.2～4.6，營養(yǎng)需要復雜。接觸酶為陰性。通常在 10～45℃能生長(最適 37℃)，在 pH 值為 9.6、6.5%氯化鈉中和 40%膽鹽中也能生長，個別菌種在 50℃時生長快，水解吡咯烷基-b-萘胺。很少還原硝酸鹽，通常發(fā)酵乳糖、通常為 Lancefield 血清 D 群，大多數(shù)腸球菌不產(chǎn)生色素，極少數(shù)產(chǎn)黃色色素。廣泛出現(xiàn)于自然環(huán)境中，特別是脊椎動物的糞便中。DNA 的(G+C)含量為 37%～45%(摩爾分數(shù))。
3 益生腸球菌的應用特性及其作用機理
益生腸球菌作為乳酸菌的一種，通過自身及其代謝產(chǎn)物調(diào)整菌群之間的關(guān)系，維持和保證菌群最佳優(yōu)勢組合的穩(wěn)定。益生腸球菌必須具備某種特性如安全、黏附、競爭排斥、占位和產(chǎn)生抑制物等，才能在微環(huán)境中保持優(yōu)勢。
3.1 應用的安全性
腸道菌群可視為生物體的正常的菌群，這些正常菌群直接參與宿主的生理代謝活動，是宿主正常生理活動不可缺少的重要組成部分，其中糞腸球菌是最為常見的菌，占 82%～87%，其次是屎腸球菌，占 8%～16%。內(nèi)源性腸球菌作為人體內(nèi)正常菌群之一主要定植于回腸和結(jié)腸部，有些菌株可直接參與宿主的物質(zhì)代謝過程。例如，可直接參與膽固醇的代謝，并對異常代謝進行調(diào)整，使之恢復正常。益生菌制劑產(chǎn)品的安全直接體現(xiàn)在菌種的安全性上，許多益生腸球菌和乳酸桿菌一樣，因其具有良好的生物安全性，很早就被人們有意無意地在食品、醫(yī)藥和飼料上使用。對腸球菌的應用主要集中于糞腸球菌和屎腸球菌，最早利用糞腸球菌的是日本首先開發(fā)出來的，用于治療各種腸道疾病。日本目前市場上出售的含有糞腸球菌的酸奶制品或藥品有清水制藥生產(chǎn)的Lascpan、朝日啤酒株式會社生產(chǎn)的新Lacton、若素制藥生產(chǎn)的Lebenin、武田制藥生產(chǎn)的Biosmin、韓國生產(chǎn)的用于治療嬰幼兒腸道疾病的益生菌制劑“媽咪愛”等。其中有些產(chǎn)品，如“媽咪愛”目前已打入中國市場。在歐洲一些國家如德國和瑞典生產(chǎn)的益生菌制品如Ventrux、Bioflorin、Fio rmil等都含有屎腸球菌，其活菌數(shù)一般在 108 ～109 /g。
3.2 生長代謝快，具有較好的黏附力
腸球菌生長代謝快，任曉燕等報道糞腸球菌在培養(yǎng) 6h 后就進入了對數(shù)增長期，并持續(xù)到 14h，16h～18h 進入穩(wěn)定期，18h 后進入衰亡期。能夠在胃腸道上皮細胞上粘附，益生菌能粘附在腸道中生長繁殖是發(fā)揮作用的基本條件之一，是保證其有效的競爭排斥病原菌的定植，并充分發(fā)揮其生物功能的前提。益生屎腸球菌表面由脂磷壁酸(LTA)、完整肽聚糖(WPG)、多糖和表面層蛋白(SLP)構(gòu)成，這些物質(zhì)在黏附和定值中起到主要作用。宿主細胞有相應的特異性黏附性受體，黏附作用才會發(fā)生。MarciAakova 等從青貯飼料中篩選出腸球菌 EF9296，并證明它對人腸粘膜及犬齒動物腸粘膜都具有較好的粘附力(人類粘膜：5.5 log 10 cfu/m1，犬齒動物腸粘膜：4.7 log 10 cfu/m1)。Laukova 等比較了腸球菌對不同宿主的黏附特性，研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌和屎腸球菌對同一宿主的黏附力沒有顯著性差異，而且腸球菌對不同宿主的黏附力也無顯著性差異。Strompfova 等從狗糞便中篩選 40 株腸球菌，實驗證明它們對人腸粘膜的的粘附力為 5%～8%，對犬齒動物腸粘膜的粘附力為 4%～11%，粘附力在宿主間無差異。
3.3 產(chǎn)生益生物質(zhì)
益生腸球菌在體內(nèi)發(fā)酵糖類，產(chǎn)生大量的乙酸和乳酸，使腸道內(nèi)的 pH 和氧化還原電位值 Eh 下降，腸道處于酸性環(huán)境，對于病源性細菌有拮抗作用，從而抑制其增殖。很多年前，已有很多學者報道腸球菌可以產(chǎn)生細菌素。細菌素(bacteriocin)是由某些細菌利用核糖體合成機制產(chǎn)生的一種具有抗菌作用的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)。主要通過專一性地吸附到敏感細胞表面的受體上，而后發(fā)揮其不同的作用，如形成細胞質(zhì)膜離子透性通道，引起離子滲漏，造成電子傳遞體的解偶聯(lián)，影響 ATP 的合成和某些物質(zhì)的運輸，抑制蛋白質(zhì)、DNA，RNA 等大分子物質(zhì)的合成等，最終導致細胞死亡，從而起到消炎、抗菌等作用。Du Toit 等從小型豬糞便中分離出屎腸球菌和糞腸球菌，研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌產(chǎn)生的細菌素抑菌范圍較窄，主要針對致病型腸球菌，而屎腸球菌產(chǎn)生的細菌素的抑菌范圍較寬，除了對致病型腸球菌還對李斯特菌屬、梭狀芽孢菌屬及丙酸桿菌屬都具有抑制作用。Kang 等從嬰兒糞便中分離出腸球菌 GM-1，它產(chǎn)生了一種類似伏爾加霉素 P 的細菌素，這種細菌素具有較強的熱穩(wěn)定性而且具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有抑制作用。Strompfova 等從雞嗉囊中分離出屎腸球菌 EF55，并證明它所產(chǎn)生的細菌素(BLIS)對革蘭氏陽性菌具有廣泛的抑菌作用，但對革蘭氏陰性菌沒有抑制作用等。
3.4 降低膽固醇
益生腸球菌能降低高脂血癥，被認為是能降低脂肪吸收的腸肝循環(huán)，這些菌在腸道中通過氧化，能使分泌到腸道內(nèi)的飽合膽汁酸脫飽合或使其脫羥基或發(fā)生其他變化，促進膽汁中的膽固醇轉(zhuǎn)化為人體不吸收的糞固醇，不能再通過肝腸循環(huán)回到肝臟進而降低血液膽固醇水平。日本河谷康雄曾從健康人腸道中分離出一株具有降低膽固醇的菌株，糞腸球菌 AD1001。袁杰利等的毒理學試驗結(jié)果證明，屎腸球菌 DM891129 菌株屬無毒、弱蓄積，無遺傳毒性。功效試驗表明，高中低劑量組均可降低實驗高脂血癥大鼠血膽圊醇，從而起到調(diào)節(jié)血脂作用。
3.5 增強機體免疫作用
益生腸球菌可以作為非特異性免疫調(diào)節(jié)因子，增強腸道非特異性免疫能力，促進巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6，激活淋巴細胞，增加血液中免疫蛋白的含量，提高機體抵抗病原菌的能力。Jalil Ben yacoub等在幼狗日糧中添加屎腸球菌SF68，從斷奶到 1 歲，研究發(fā)現(xiàn)屎腸球菌SF68 可以提高糞中IgA，抗犬瘟熱病毒(anti distemper virus，CDV)的IgG和IgA的水平及淋巴細胞的比例。CD4+和CD8+T細胞的數(shù)量沒有顯著性差異，但是成熟B細胞的比例有所增加。 這說明屎腸球菌SF68 可以提高幼狗的免疫力。Benyacoub等研究了七日前口服屎腸球菌SF68對灌服腸賈第蟲的小鼠的保護作用，發(fā)現(xiàn)口服屎腸球菌SF68 組的小鼠的特異性抗腸賈第蟲的IgA和血液IgG的水平及Peyers斑和腎臟中的CD4+T細胞數(shù)量顯著增加。屎腸球菌SF68 可以增強粘膜免疫和系統(tǒng)免疫。
4 益生腸球菌在斷奶仔豬的上應用
仔豬早期斷奶給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的經(jīng)濟效益，但過早斷奶極易導致“仔豬早期斷奶綜合癥”，主要表現(xiàn)為斷奶后腹瀉、水腫病和內(nèi)毒素休克。斷奶后腸道大腸桿菌濃度上升被認為是導致仔豬腹瀉的主要原因之一。大量研究表明仔豬斷奶后腸道菌群改變明顯，總的趨勢是大腸桿菌等致病菌濃度上升，乳酸菌等有益菌濃度下降。張振斌等試驗結(jié)果表明，斷奶應激使仔豬胃和空腸內(nèi)容物 pH 值升高，直腸糞便中大腸桿菌數(shù)量增加，乳酸桿菌數(shù)量減少，而且空腸內(nèi)容物 pH 值和直腸糞便中大腸桿菌數(shù)量是反映仔豬腹瀉的敏感指標。Franklin 報道 24 日齡斷奶仔豬在斷奶三天后的空腸、回腸和盲腸的大腸桿菌數(shù)比斷奶前減少(P<0.05)，而乳酸桿菌數(shù)增多(P<0.05)。
針對仔豬早期斷奶綜合癥的發(fā)病機理和癥狀，研究者們開始嘗試用微生態(tài)制劑的原理和方法治療該種疾病。卞榮星研究表明仔豬的飼料日糧中添加 0.1%糞腸球菌一牛至香精油復合物，可以明顯降低仔豬哺乳階段及斷奶后仔豬腹瀉的發(fā)生率，增加動物的生產(chǎn)性能。Nelson 等報道在斷奶仔豬日糧中添加篩選具有一定抗逆性的四種潛在乳酸菌(包括腸球菌)可以增加仔豬采食量，提高日增重及飼料轉(zhuǎn)化率而且可以顯著地減少糞便中大腸桿菌的數(shù)量 (P<0.05)。JIN研究證明腸球菌能夠抑制大腸桿菌 K88ac 和 K88MB 粘附到小腸粘膜上，并 對大腸桿菌 K88ac 的抑制作用具有劑量效應，當活菌數(shù)達到 109 時，抑制效率在 90%以上。Strompfova 等給仔豬日糧中添加屎腸球菌 EKl3，研究表明，屎腸球菌 EKl3 可以顯著提高血清總蛋白、鈣、血紅蛋白、紅細胞濃度及顆粒細胞吞噬指數(shù)，顯著降低仔豬糞便中大腸桿菌的數(shù)量。但 Broom 等報道在斷奶仔豬日糧中添加糞腸球菌對仔豬的日采食量，日增重及飼料轉(zhuǎn)化率等生產(chǎn)性能沒有影響，對胃腸道菌落組成也沒有影響，但能降低斷奶仔豬 20 天血清 IgG 的含量(P<0.1)。Taras 等研究發(fā)現(xiàn)腸球菌對斷奶仔豬生產(chǎn)性能沒有顯著的增加，但有提高飼料轉(zhuǎn)化率的趨勢，而且可以減少潛在致病型大腸桿菌的量，進而減少仔豬腹瀉發(fā)生率。Pollmann 等報道屎腸球菌可以減少衣原體專性細胞病毒浸染仔豬發(fā)生率。
5 益生腸球菌存在的問題及發(fā)展前景
益生腸球菌具有無毒副作用、促進動物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率、可替代抗生素等優(yōu)點。但由于存在菌種的篩選、活菌數(shù)、菌種的失活、雜菌含量的多少、使用條件等問題而導致益生腸球菌制劑活性降低，出現(xiàn)使用效果的重復性和穩(wěn)定性較差等。
為了提高益生菌制劑的活性和效力，人們不斷的展開了新菌種的篩選和新劑型的研制工作。微膠囊技術(shù)就是其中發(fā)展較為迅速、應用較為廣泛的一種。微膠囊是指利用天然或合成的高分子材料對固體、液體或氣體進行包封，粒徑為 5～1000μm 的中空膠囊，制備微膠囊的過程稱為微膠囊化。包封用的壁殼稱為壁材，被包的囊芯稱為芯材，芯材可以是單一的，也可以是復合的。囊壁厚度一般為 0.1～200μm 之間，微膠囊的粒子大小，因制備工藝及途不同而不同。常用制備微膠囊的方法有：相分離法、界面聚合法、噴霧冷卻和噴霧干燥法、擠壓法、雙重乳狀液法。目前，國外已有此類產(chǎn)品進入到我國的市場上，如瑞士的糞鏈球菌微膠囊“賜美健”、荷蘭的“百福菌”等，但是價格很高，難以大規(guī)模使用。
因此，研究對益生腸球菌等低抗逆性微生物進行微膠囊化包被，并提供一條適用的工業(yè)化途徑，使其穩(wěn)定性增強，貯存期延長，并可以與其它飼料原料共存、共用，將對微生態(tài)制劑在我國飼料行業(yè)的廣泛應用產(chǎn)生重大的意義。 因此，建議今后有關(guān)益生腸球菌添加劑的研究和開發(fā)應該加強以下幾方面的工作：從細胞水分和分子水平深入研究益生腸球菌的作用機理；加強益生腸球菌新劑型的開發(fā)，提高其穩(wěn)定性和有效性；規(guī)范產(chǎn)品標準及檢測手段。
注：給牲畜飼料中添加抗生素會引發(fā)牲畜的抗微生物抗性，消費者在食用了這些牲畜制成的肉制品和乳制品后也會受到其抗微生物抗性的影響，為了加強管理，全球三大國際性食品健康機構(gòu)日前正在計劃出臺一項全球性的法規(guī)。聯(lián)合國糧農(nóng)組織 FAO、國際動物衛(wèi)生組織 OIE 和世界衛(wèi)生組織 WHO 共同提出了上述建議。他們提出了使用獸用藥品的風險評估發(fā)展階段，引用了“抗性開端”概念來對藥品使用過量進行控制。三大組織還提出應該建立抗生素等級分類，應該徹底禁止對動物使用抗生素，以防止對人類產(chǎn)生巨大危害。
（本文僅供學習參考使用）
